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科研服务

蛋白质翻译后修饰

蛋白质翻译后修饰组学产品


常规的蛋白质组学研究往往只关注不同生理、病理条件下蛋白质表达水平的变化。然而,越来越多的研究发现,许多重要的生命活动、疾病发生不仅与蛋白质的丰度相关,更重要的是被各类蛋白质翻译后修饰所调控。因此深入研究蛋白质翻译后修饰对揭示生命活动的机理、筛选疾病的临床标志物、鉴定药物靶点等方面都具有重要意义。由于翻译后修饰的蛋白质在生物样本中含量低、动态范围广,质谱分析前需要对修饰进行富集以提高其丰度。


技术原理:


首先将蛋白样本酶解成肽段混合物,然后使用液相色谱对酶解后的肽段混合物进行组分分离以降低样本复杂程度,然后通过高质量的修饰类抗体和生物材料对修饰肽段进行富集,最后上样至液相色谱 - 串联质谱中进行分析,通过相应的数据库检索匹配,一次可鉴定成百上千个修饰位点。


PTM蛋白质修饰位点分析


技术原理:


> 蛋白质磷酸化位点分析


样品经酶解后,用 TiO2 微球对磷酸化肽段进行富集,富集后的产物由高精度质谱分析,并通过专业软件完

成数据检索。


原理11.PNG

> 蛋白质 N- 糖基化位点分析


蛋白质经过酶解后利用凝集素(lectin)富集 N- 糖基化肽段,然后用 N- 糖酰胺酶(PNGase)在 H O 中

切除连接在天冬酰胺残基(Asn)上的糖链。该处理致使 Asn 分子量增加 2.9890Da。最后用高精度 LC-MS

质谱仪检测脱糖后的肽段,并通过 MASCOT 软件检索数据库,确认脱糖后分子量与其理论分子量的变化以

及糖基化修饰肽段的序列,从而确定该蛋白质的 N- 糖基化位点。


1.PNG

定量磷酸化蛋白质组学


蛋白质发生磷酸化是重要的翻译后修饰,它与信号传导、细胞周期、生长发育以及癌症机理等诸多生物学问题有密切关系。研究蛋白质磷酸化对阐明蛋白质功能具有重要意义。将磷酸化肽段TiO2富集技术和iTRAQ/TMT/Lable free技术相结合,实现对磷酸化蛋白质组学的定量研究。


技术原理


在磷酸化肽段富集前先进行 iTRAQ/TMT 标记,然后通过 TiO2 富集方法获得高纯度的磷酸化肽段,最后结合高分辨率质谱完成对样品的定量分析。


定量N-糖基化蛋白质组学


蛋白质的N-糖基化位点修饰是最重要的蛋白质翻译后修饰之一,主要在复杂的多细胞或组织形成过程中起关键作用。蛋白质的N-糖基化修饰位点具有保守的氨基酸序列NX(S/T)(其中X为除脯氨酸以外的其它氨基酸)


凝集素亲和法是目前糖蛋白质组学中应用最广泛的分离富集方法。凝集素(lectin)是一类糖结合蛋白质,能专一识别某一特殊结构的单糖或聚糖中特定的糖基序列而与

之结合,它们与糖链可逆非共价结合,糖蛋白或糖肽被凝集素捕获之后,通常用特定的单糖通过竞争结合凝集素将糖蛋白或糖肽洗脱下来。蛋白质经过酶解后利用lectin 富集 N- 糖基化肽段,然后用 N- 糖酰胺酶(PNGase)在 H218O 中切除连接在天冬酰胺残基(Asn)上的糖链。该处理致使 Asn 分子量增加 2.9890Da。最后用高精度 LC-MS 质谱仪检测脱糖后的肽段,并通过 MASCOT 软件检索数据库,确认脱糖后分子量与其理论分子量的变化以及糖基化修饰肽段的序列,从而确定该蛋白质的 N- 糖基化位点。N- 糖基化位点确定之后,再利用 label-free 的原理对其进行定量分析。


定量泛素化蛋白质组学


泛素化是指泛素分子在一系列特殊的酶作用下,将细胞内的蛋白质分类,从中选出靶蛋白分子,并对靶蛋白进行特异性修饰的过程。


技术原理


样品经胰蛋白酶 Trypsin 酶切,酶切产物由泛素化特异性抗体 (Cell Signaling Technology 5562S)进行泛素化肽的富集,富集后由高精度质谱 Q Excative(Thermo Scientific)分析,分析数据由生物信息学软件进行数据检索。