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科研服务

RNA甲基化测序

RNA 甲基化指发生在RNA 分子上不同位置的甲基化修饰现象,常见的RNA转录后修饰方式有6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A) 和5-甲基胞嘧啶(C5-methylcytidine,m5C)。

最新研究发现,m6A修饰在调控基因表达、剪接、RNA 编辑、RNA 稳定性、控制mRNA寿命和降解、介导环状RNA翻译等方面扮演重要角色。因此MeRIP-seq助力解决细胞分化、生物发育、疾病发生发展、热休克反应等生物学问题。

利用甲基化RNA免疫共沉淀结合高通量测序 (Methylated RNA Immunoprecipitation sequening,MeRIP-seq)技术,可以对RNA转录后甲基化修饰图谱进行全面研究,是表观转录组学研究的关键技术。

简介

表观遗传学,包括组蛋白共价修饰(covalenthistone modification)、DNA 甲基化修饰(DNAmethylation)、RNA 甲基化修饰(RNA methylation)、基因组印记(genomic imprinting)、基因沉默(genesilencing)、RNA 编辑(RNA editing)及非编码RNA(noncoding RNA)等,是指在核苷酸序列不发生改变的情况下,生物表型或基因表达发生了稳定的可遗传变化。RNA 甲基化作为表观遗传学研究的重要内容之一,是指发生在RNA 分子上不同位置的甲基化修饰现象, 6- 甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)是真核生物中常见的RNA 转录后修饰。RNA 甲基化在调控基因表达、剪接、RNA 编辑、RNA 稳定性、控制mRNA寿命和降解等方面可能扮演重要角色。 相对于DNA 甲基化,RNA 甲基化更加复杂、种类繁多、普遍存在于各种高级生物中。

RNA甲基化技术路线1.png


m6A修饰的机制与功能


m6A 甲基化修饰是由一个多蛋白复合物介导产生,目前已知这个复合物的成分包括METTL3,METTL14 和 WTAP;去甲基化酶 FTO 和 ALKBH5则负责擦除甲基化修饰基团。在细胞核中的 HNRNPC 负责识别m6A修饰基团,并介导mRNA前体的选择性剪接。而另外一个m6A识别蛋白 HNRNPA2B1则促进 pri-miRNA 加工成 pre-miRNA。在细胞质中,不同的 m6A 位点识别蛋白介导不同的功能。YTHDF1 和YTHDF3识别 m6A 修饰 mRNA,通过与起始因子及核糖体相互作用促进蛋白质翻译,eIF3识别蛋白也会直接绑定到 mRNA 5’UTR 端的 m6A位点参与翻译起始。而另外一个识别蛋白 YTHDF2 与 m6A 的结合将导致 mRNA 的降解。

技术原理

MeRIP-seq 测序文库制备过程如下:首先从样本细胞组织中分离出RNA,考虑到总RNA 中含有大量的rRNA 序列,因此需要结合不同的方法去除其中的rRNA。对于真核生物而言,常采用Poly(T)寡核苷酸提取出带Poly(A)的RNA 去除rRNA;而对不含Poly(A)尾的转录本序列以及存在部分降解的总RNA 样本而言,需要试剂盒去除rRNA,从而得到除rRNA 外的全部RNA,然后将提取出的RNA 随机打断。MeRIP-seq 技术对带有甲基化修饰的片段(IP 样本)进行测序时,需要平行对一个对照样本(Control 样本)进行测序, 其IP 样本和Control 样本的片段选择方法主要有以下2 种:a.将打断的RNA 片段分成两份,一份直接用于制备Control 样本的cDNA 文库,另一份采用抗m6A抗体与被打断的RNA 进行孵育,抓取带有m6A 修饰的片段,用于制备IP 样本的cDNA 文库.由于测序得到的结果不以所有RNA 片段为背景,称这样得到的IP 样本和Control 样本是非成对的(unpair),在进行数据处理时需先对Control 样本进行处理。b.取两份相同的RNA 进行打断,其中一份所有的RNA 片段都进行测序,作为Control样本,另一份采用抗m6A 抗体抓取带有m6A 修饰的片段进行测序作为IP 样本。由于测序得到的IP样本背景为当前测序得到的Control 样本,称这样得到的IP 样本和Control 样本是成对的(pair),可直接用于数据处理。获取测序片段后(包括IP 样本测序片段和Control 样本测序片段),用随机引物和反转录酶从RNA 片段合成双链cDNA。然后,对合成的cDNA进行末端修复并在3′端加“A”,使用特定测序接头(adapter)连接cDNA 片段两端,从而得到用于测序的cDNA。通常情况下,为了得到更高的测序效率,一般采用电泳切胶法获取一定长度的cDNA,再对其进行PCR 扩增,得到所需的cDNA 文库。


RNA甲基化技术.jpg

实验设计

实验组VS对照组,建议3-5:3-5

组内对照:IP组VS in put组(input组主要用于比较鉴定IP组的抗体特异性结合,是必备的组分)

测序模式:PE150

数据量:20M clean reads


项目周期:50天